第一章 概论
第一节 绪论
1.免疫：是指机体的免疫系统识别和排除抗原性异物以维持机体的生理平衡和稳定的功能
2.免疫系统的主要功能
| 免疫功能 | 生理性反应（有利） | 病理性反应（有害） | 理解 |
| 免疫防御 | 清除病原微生物 | 增强：超敏反应 减弱：免疫缺陷病 | 杀细菌 |
| 免疫自稳 | 清除损伤细胞或衰老细胞 | 增强：自身免疫性疾病 | 杀自己 |
| 免疫监视 | 清除突变或畸变的恶性细胞 | 减弱：恶性肿瘤 | 防肿瘤 |
3.免疫应答：是指机体的免疫系统接受抗原刺激发生一系列反应，并以排出或分解该抗原为目的的反应过程
4.免疫应答基本过程：识别阶段、活化阶段、效应阶段
①识别阶段：巨噬细胞等抗原提呈细胞对外来抗原或变性抗原进行识别、摄取、降解和提呈抗原信息给辅助性T细胞及相关淋巴细胞的阶段
②活化阶段：是T、B淋巴细胞在接受抗原刺激信号后，发生活化、增殖、分化的阶段
- B细胞活化、增殖、分化为浆细胞产生抗体，体液免疫
- T细胞活化、增殖、分化为效应细胞，细胞免疫
③效应阶段：
- 浆细胞分泌特异性抗体，执行体液免疫功能
- T细胞：
- 杀伤性T细胞（CTL）执行细胞毒效应
- 辅助性T淋巴细胞（Th）分泌细胞因子等效应分子
适应性免疫/获得性免疫/特异性免疫：T细胞、B细胞接触抗原发生活化、增殖和分化，产生效应细胞（如杀伤性T细胞）、效应分子（如抗体、细胞因子等）和记忆细胞
适应性免疫应答的基本过程：识别阶段、活化阶段、效应阶段
第二节 免疫组织和免疫器官
免疫系统的概念：由免疫器官、免疫细胞、免疫分子组成的系统
中枢免疫器官：是免疫细胞产生、分化、成熟的场所。由骨髓和胸腺组成
- 骨髓：是重要的造血器官，是成人和动物所有血细胞和淋巴细胞（T、B）的发源地
- 胸腺：T细胞发育的重要中枢器官
骨髓：B淋巴细胞成熟的场所
胸腺：T细胞分化发育成熟的免疫器官
外周免疫器官包括：淋巴结、脾脏（人体最大的外周免疫器官）、黏膜相关淋巴组织（扁桃体、小肠派氏淋巴结、阑尾）
功能：
- 是免疫应答的场所
- 淋巴细胞再循环的起点、中途站和归巢的终点是外周免疫器官及外周淋巴组织
第三节 免疫细胞
一、免疫细胞的分类
1.免疫细胞：凡参与免疫应答或免疫应答有关的细胞统称为免疫细胞
2.免疫细胞分类
（1）淋巴细胞：T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞
（2）单核-吞噬细胞，辅助作用
（3）参与免疫应答的细胞：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞
3.免疫细胞的功能和表面标志
T细胞（胸腺依赖淋巴细胞）：
- T细胞受体（TCR）：又称T细胞抗原受体，是T细胞特有的表面标志，可表达于所有的成熟T细胞表面
- CD3：T细胞共同的标志性抗原
- CD2：绵羊红细胞受体/E受体（E花环实验）
区别T细胞亚群的重要标志是CD4/CD8
- CD4：辅助性T细胞（Th）
- CD8：细胞毒性T细胞/杀伤T细胞（TC/CTL）（正常人CD4+/CD8+T细胞的比值→1.7-2.2:1）
| 淋巴细胞亚群及其功能 | ||
| CD4+T细胞/ 辅助T细胞（Th） | 分泌细胞因子，促进和增强免疫应答 | Th1细胞：分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β |
| Th2细胞：分泌IL-4、5、6、10 | ||
| CD8+T细胞/ 细胞毒性T细胞（CTL/Tc） | 特异性识别内源性抗原肽-MHCⅠ类分子复合物，特异杀伤靶细胞（肿瘤细胞），介导细胞免疫。肿瘤细胞被细胞毒性T细胞杀伤的关键条件是表达MHCⅠ类分子 | |
B细胞（骨髓依赖性淋巴细胞）：
Smlg：膜免疫球蛋白（BCR），为B细胞所特有的
识别和捕捉抗原
未成熟B细胞的mlg主要是mlgM
成熟B细胞的mlg主要是mlgM和mlgD
CD19：成熟B细胞均表达，传递活化信号
CD20：特异性标志
B细胞亚型：B1细胞（CD5+）、B2细胞（CD5–）
自然杀伤细胞（NK）：是一类可非特性直接杀伤肿瘤和病毒感染靶细胞的固免疫淋巴细胞。表面标志为：CD56+CD3–CD16+
抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）：NK细胞、抗体lgG
抗原提呈细胞（APC）：指能摄取、加工、处理抗原，并将抗原提呈给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞
| 分类 | 特点 |
| “专职”抗原提呈细胞 | 单核-吞噬细胞（CD14）、树突状细胞（DC）、B细胞 |
| “非专职”抗原提呈细胞 | 内皮细胞、上皮细胞、激活T细胞 |
二、免疫细胞的分离、保存
1.单个核细胞分离
- 外周血单个核细胞的分离：Ficoll分离液
- 淋巴细胞的分离：Percoll分离液法
2.免疫细胞的分离：T细胞和B细胞的分离
①E花环沉降法：T细胞有绵羊红细胞受体（E受体/CD2受体）
②EA花环沉降法：B淋巴细胞表面有IgG Fc受体，能与免疫球蛋白（IgG）的Fc段结合，因此用抗体致敏的鸡红细胞与B淋巴细胞混合，可见B淋巴细胞周围粘附有鸡红细胞
3.免疫细胞的分离：T细胞亚群的分离
分离淋巴细胞亚群的原则是根据相应细胞的特性和不同表面标志
- 亲和板结合分离法：各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原表位
- 磁性微球分离法
- 荧光激活细胞分离仪分离法
4.免疫细胞表面标志的检测方法：
①抗体致敏细胞花环法
②免疫细胞化学法
细胞酶免疫组织化学技术，以酶标抗体与细胞上特异性受体结合，普通显微镜观察着色细胞的百分率进行定量分析
③免疫荧光法
以荧光标抗体与细胞上特异性受体结合，荧光显微镜观察发出荧光细胞的百分率进行定量分析
④流式细胞分析法
5.免疫细胞分离后的保存：
- 待保存的细胞活力测定应合格
- 长期保存液氮深低温（-196℃）环境保存细胞
- 深低温环境下可中断细胞代谢
- 可利用两步降温法
- 加入二甲亚砜作为保护剂
三、淋巴细胞的功能检测
（一）T淋巴细胞功能检测
1.T淋巴细胞增殖/转化试验（体外试验）
（1）T细胞在体外受到有丝分裂原或抗原的刺激后，细胞的代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应，如细胞变大、细胞体积增大，核内DNA和胞浆内RNA合成增加、胞质增多、胞质出现空泡、核染色质疏松、核仁明显，并转化为淋巴母细胞
(2)刺激物：
①非特异性丝裂原：植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）和美洲商陆（PWM）
②特异性抗原：结核分枝杆菌的纯蛋白衍生物（PPD）、破伤风类毒素
（3）检测方法：形态学检查法、3H-TdR掺入法（放射性核素法）、MTT比色法激活的淋巴细胞摄取DNA合成的前体-3H标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入量的多少来判定
2.T细胞介导的细胞毒试验
淋巴细胞介导的细胞毒性是细胞毒性T细胞（CTL）的特性，凡致敏的T细胞再次遇到相应靶细胞抗原时，可表现出破坏和溶解靶细胞，它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标
3.体内试验
体内皮肤试验：结核菌素试验（OT/PPD）
（二）B淋巴细胞功能检测
1.溶血空斑试验
第四节 免疫分子
1.免疫分子：指的是由一些免疫活性细胞或相关细胞分泌的参与机体免疫反应或免疫调节的蛋白质及多肽物质
2.免疫分子分类：
- 免疫球蛋白
- 补体
- 细胞因子
- 细胞黏附分子
- 人类白细胞分化抗原
（1）免疫球蛋白
①免疫球蛋白（Ig）：B细胞经抗原刺激后增殖分化为浆细胞后产生的、存在于血液和体液中能与相应抗原特异性结合、执行体液免疫功能的一组球蛋白
②免疫球蛋白分类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE
- 抗体（Ab）：是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，主要存在于血清等体液中，通过与相应抗原特异性结合，发挥体液免疫功能
- 免疫球蛋白（Ig）：是指具有抗体活性并具有抗体化学结构的球蛋白
③免疫球蛋白的化学组成及结构
Ig分子由4条肽链组成：2条相同的重链（H）：γ、α、μ、δ、ε链。2条相同的轻链（L）：κ、λ链
V何变区：抗原结合位点
- 按重链恒定区抗原性（CH）将免疫球蛋白分为lgG、lgA、IgM、lgD、lgE
超变区（HVR）：是结合抗原表位的部位，又称互补决定区（CDR）
免疫球蛋白片段的制备：将免疫球蛋白分解成Fab片段、Fc片段、轻链片段的方法：
- 木瓜蛋白酶：lgG裂解成2个Fab片段及1个Fc片段
- 胃蛋白酶：lgG裂解成F（ab‘）2片段
④免疫球蛋白的特征与功能
lgG：
- 血清中含量最高的免疫球蛋白，以IgG1含量最高
- 血液和细胞外液的主要抗体
- 潜伏期长，抗体合成率高，抗体高峰滴度高，亲和力高
- 再次免疫应答的主要抗体
- 大多数抗菌、抗病毒、抗感染抗体是IgG
- 自身抗体都为IgG类
- IgG是唯一能通过胎盘的抗体
IgM：
- 为五聚体，是分子量最大的免疫球蛋白，又称巨球蛋白
- 是个体发育过程中最早合成和分泌的抗体；为低亲和力抗体
- 抗原刺激后体液免疫应答中最先产生的抗体，感染过程中血清IgM水平升高，说明近期感染
- 激活补体能力最强
- 天然凝集素和冷凝集素
冷凝集素综合征：免疫球蛋白（IgM）引起的自体免疫性疾病。
在较低的温度下，这种抗体能作用于患者自己的红细胞，在外周的末梢微循环发生凝集，导致手足紫绀症。当温度上升至20-25℃时，补体激活，破坏红细胞发生溶血。在37℃温度，抗体与红细胞抗原发生完全可逆的分解，症状迅速消失
IgA：
- 分泌型（slgA）：二聚体结构。是参与黏膜局部免疫的主要抗体，主要存在于胃肠道、支气管分泌液、初乳、唾液、泪液中
- 母乳中slgA提高婴儿出生后4-6个月内的局部免疫屏障，常称为局部抗体
- 属于黏膜免疫系统的免疫器官是扁桃体
IgE：
- IgE为单体结构，正常血清中含量最少的免疫球蛋白
- IgE为亲细胞抗体（与肥大细胞和嗜碱性粒细胞亲和），可引起Ⅰ型超敏反应
- IgE可能与机体抗寄生虫免疫有关
（2）补体
①补体（C）：是一组存在与人和脊椎动物血清中具有酶样活性、不耐热的糖蛋白（多属于β球蛋白）。其可辅助抗体发挥溶细胞作用。参与免疫病理反应
含量最低、分子量最小：D因子
分子量最大：C1分子
正常血清中含量最高的补体成分为C3、C4
②补体的化学性质：很不稳定，冷冻干燥可较长时间保持其活性
- 不耐热，56℃30分钟可灭活
- 强酸强碱可灭活
- 强烈震荡（机械性振荡）可灭活
- 某些添加剂（乙醚、乙醇、蛋白酶）可灭活
- 紫外线照射可破坏补体
③补体的活化途径：经典途径、MBL途径、旁路途径/替代途径/第二途径
识别阶段、活化阶段、MAC膜攻击阶段（膜攻击复合物：C5+C6+C7+C8+C9）
补体其可辅助抗体发挥溶细胞作用。参与免疫病理反应
B淋巴细胞功能检测——溶血空斑试验
经典途径：C1→（抗原-抗体复合物（IgM、IgG1、IgG2、IgG3））→激活的C1→（C4+C2）→C4b2b→C4b2b3b→C5b6789n
旁路途径：细菌脂多糖（LPS）、凝聚的IgA→C3→（B因子）→C3bBb→C3bBb3b→参与宿主抗细菌、抗病毒防御机制
C1抑制分子缺陷（遗传性血管神经性水肿）
C1酯酶抑制剂的合成功能障碍或功能缺陷所致的常染色体显性遗传病
补体含量显著降低见于：
- 消耗增多：RA、SLE、自身免疫性溶血、移植排斥反应
- 细菌感染：特别是革兰阴性细菌感染时，常因补体旁路途径的活化而引起血清补体水平的过度降低
- 合成不足：严重肝病或营养不良时，由于蛋白合成障碍，可不同程度地引起血清补体水平的下降
- 大量丧失：大面积烧伤、大出血、肾病综合征
补体总活性测定
①补体50%溶血实验（CH50测定）：
- 绵羊红细胞（SRBC）抗体与SRBC表面的抗原结合，激活补体（经典途径），形成膜攻击复合物，导致红细胞肿胀溶解
- SRBC抗体与SRBC的量恒定时，待测血清中补体越多，溶血程度高（呈现特殊的S形曲线）
- 以体系50%溶血时的最小血清量反映补体总活性。最易观察，最敏感
②补体结合实验
补体结合试验分为三个系统：反应系统、补体系统、指示系统（溶血素+红细胞）
（3）细胞因子
①细胞因子的性质、功能：
- 是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质
- 其化学本质是蛋白质或小分子多肽，大多为糖蛋白
- 生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应；调节多种细胞生理功能
- 其生物活性常表现为多效性、重叠性、拮抗效应、协同效应
- 细胞因子可以旁分泌、自分泌或内分泌的方式发挥作用
②细胞因子的分类：
- 白细胞介素（IL），多系集落刺激因子：IL-3
- 干扰素（IFN）
- 生长因子
- 趋化因子家族
- 肿瘤坏死因子（TNF）
- 集落刺激因子（CSF）
第二章 抗原抗体反应
第一节 抗原抗体反应的原理
1.抗原抗体反应：是指抗原与相应的抗体特异性结合的反应。抗原决定簇（表位）和抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性
2.抗原抗体结合力：抗原抗体是一种非共价的结合，不形成共价键，需要四种分子间引力参与
- 静电引力
- 范德华引力：作用力最弱
- 氢键结合力
- 疏水作用力：最强
蛋白质分子在水溶液中要维持稳定（也就是说分子和分子不是聚在一起，而是独立存在的），需要在分子外面形成水化膜（亲水胶体）。所以如果抗原、抗体相互靠近（抗原表位和抗体超变区靠近时），结合时，需要把分子外面的水化膜排掉。所以在抗原抗体结合的部位需要形成疏水的空间，暴露抗原抗体结合位点。疏水作用力是这些结合力中最强的，因而对维系抗原抗体结合作用最大。抗原抗体结合变成疏水胶体
第二节 抗原抗体反应的特点
1.抗原抗体反应的特点：特异性、比例性、可逆性、阶段性
①特异性：指抗原决定簇与抗体的超变区之间的互补性
交叉反应：天然抗原分子通常具有多种抗原表位 可刺激机体产生多种特异性抗体。若两种不同的抗原分子具有部分相同或类似结构的抗原表位，则可与彼此相应的抗血清发生交叉反应
外斐反应（Weil-Felix）：变形杆菌与立克次体之间有相同的抗原表位，故可用变形杆菌代替立克次体抗原与怀疑立克次体感染的病人的血清做凝集试验，协助诊断斑疹伤寒（立克次体病）
②比例性：在抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关
最适比（等价点）：最迅速出现可见反应的抗原抗体的浓度比或量比
- 抗原抗体反应形成明显沉淀物的条件是抗原抗体比例合适
- 比例合适的范围称为等价带
- 最大的沉淀反应发生在等价带
- 若抗原或抗体极度过剩则无沉淀形成，称为带现象
- 抗体过量时，称为前带
- 抗原过量时，称为后带
③可逆性
亲和层析：固相载体对分离物质的特异亲和性（蛋白质分子的配基专一性），非目标物流过。再改变流动相使目标物质的特异性吸附消失，从而达到纯化目的
④阶段性：抗原抗体反应可分为两个阶段
第一阶段：为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应
第二阶段：可见反应阶段，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。可出现（凝集、沉淀、细胞溶解）
第三节 影响抗原抗体反应的因素
抗原抗体反应的两大影响因素：反应物自身因素（抗体、抗原）、环境因素
环境因素：
1.电解质：电解质的存在使抗原抗体失去一部分的电荷而易出现凝集或沉淀。0.85%氯化钠溶液或各种缓冲液
2.酸碱度：蛋白质的等电点PI（某pH条件下蛋白质解离呈阳性离子和阴性离子的相同的，所以蛋白质呈电中性，不带电）。pH6~9之间进行。有补体参与的反应pH为7.2~7.4
3.温度：在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。常用的抗原抗体反应温度为37℃
第三章 免疫原和抗血清的制备
第一节 免疫原
1.免疫原（相当于抗原）：指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质
2.免疫原分类
- 颗粒性抗原：指细胞抗原、细菌抗原、寄生虫抗原
- 可溶性抗原：蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸
3.用于制备免疫原的组织和细胞要求：新鲜或-40℃保存
4.半抗原：是指仅有抗原性（免疫反应性）而无免疫原性的物质
- 如多肽、甾体激素、核苷、某些药物（青霉素）等小分子物质
- 无免疫原性，只有与载体结合后才具有免疫原性
- 制备人工抗原时，常用于偶联半抗原的载体是牛血清白蛋白
第二节 免疫佐剂
1.免疫佐剂：先于抗原或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质被称为免疫佐剂
2.佐剂的作用机制：
- 改变抗原的物理性状，增强免疫原性。延缓抗原降解和排除，有效的刺激免疫系统
- 刺激单核-吞噬细胞系统，增强其处理和提呈抗原的能力
- 刺激淋巴细胞的增殖和分化。提高机体免疫应答抗体滴度
- 改变抗体类型
- 诱导迟发型超敏反应
3.常用于免疫动物的佐剂：弗氏佐剂
- 弗氏完全佐剂：液体石蜡、羊毛脂、卡介苗BCG
- 弗氏不完全佐剂：液体石蜡、羊毛脂
免疫方法与途径：有皮内、皮下、肌内、静脉、腹腔、淋巴结等途径
初次免疫一般选择皮内接种，加强免疫和颗粒性抗原一般选择静脉注射
宝贵抗原可选择淋巴结内微量注射法
4.免疫间隔时间
第1次与第2次免疫间隔时间以10~20天为好
第3次及以后的间隔一般为7~10天
应在末次免疫后5~7天及时采血
动物采血法：颈动脉采血法该法最常用，适用于家兔、绵羊、山羊等动物
第三节 抗血清
抗血清：含有抗体的血清，就是抗血清。将免疫原接种给动物，该动物在抗原刺激下，体内多个B细胞激活并产生针对某一抗原的抗体，其混合物为多克隆抗体。采集动物血液，分离血清，即得到抗血清。
| 抗体制备技术 | |
| 多克隆抗体→抗血清 | 多个B细胞激活并产生针对多个抗原的抗体 |
| R型抗血清（家兔）：亲和力强，抗原抗体结合后不易发生解离→诊断试剂 H型抗血清（马）：亲和力弱，抗原抗体结合后极易解离→免疫治疗 | |
| 单克隆抗体→杂交瘤技术 | 将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体 |
一、抗血清的分为R型和H型
R型抗血清：
- 免疫小型动物所产生的抗血清（家兔）
- 抗原抗体反应比例合适范围较宽
- 亲和力强，抗原抗体结合后不易发生解离
- 适于作诊断试剂
H型抗血清：
- 免疫大型动物所产生的抗血清（马）
- 抗原抗体反应比例合适范围较窄
- 亲和力弱，抗原抗体结合后极易解离
- 一般用作免疫治疗
二、抗血清（特异性IgG抗体）的纯化
1.盐析法
盐析法：多采用硫酸铵盐析法（辛酸硫酸铵提取法）或硫酸钠盐析法在蛋白质溶液中加入中性盐（33~50%饱和的硫酸铵），盐与水分子的亲和力大于蛋白质，可使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失，使蛋白质聚集沉淀
是最经典的蛋白质分离纯化技术。分离纯化的蛋白质不影响其活性
2.凝胶过滤法
凝胶层析/凝胶过滤：又称分子筛过滤。按蛋白质分子量大小进行分离的技术
- 单个凝胶珠本身像个”筛子”。将凝胶珠子装入柱子中，作成一个凝胶柱
- 当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来
- 比凝胶珠孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，因为小分子蛋白质运动路程长，阻力大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长
3.离子交换层析法
离子交换层析法：根据在一定pH条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法
带有正电荷的称之阴离子交换树脂
带有负电荷的称之阳离子交换树脂
4.亲和层析法
亲和层析：固相载体对分离物质的特异亲和性（蛋白质分子的配基专一性），非目标物流过。再改变流动相使目标物质的特异性吸附消失，从而达到纯化目的
用于纯化抗体、酶和受体蛋白的最好方法
5.辛酸提取法
三、抗血清的鉴定：
1.抗体特异性的鉴定
2.抗体纯度的测定
3.抗体亲和力的测定
4.抗体效价的测定
①将经过系列稀释的抗血清分别与一个浓度的抗原反应
②同时稀释抗原和抗血清，分别与不同浓度的抗血清进行双向免疫扩散试验（称为棋盘滴定：选择抗体的最适工作浓度）
四、抗血清的保存
（一）2~8℃保存：用于短期保存
（二）冷冻保存：是常用的抗体保存方法。将抗体分为小包装，在-80~-20℃保存，一般可保存5年，效价不会明显下降，但应避免反复冻融
（三）真空干燥保存：用真空冻干机进行干燥，封装后可长期保存，一般在冰箱中可保存5~10年
第四章 单克隆抗体与基因工程抗体
第一节 杂交瘤技术
单克隆抗体：将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体
1.单克隆抗体的特性：
- 高度特异性（只和相应的一个抗原决定簇结合）
- 高度的均一性和可重复性
- 弱凝集反应和不呈现沉淀反应
- 对环境高度敏感性
2.基本原理：
- 小鼠脾细胞：致敏B淋巴细胞，抗体分泌功能
- 小鼠骨髓瘤细胞：可无限分裂，具有永生性。为防止小鼠骨髄瘤细胞株返祖，应加入8-氮鸟嘌呤
- 细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）
- 选择性培养基HAT：次黄嘌呤H、甲氨蝶呤A、胸腺嘧啶核苷T
- 杂交瘤细胞保存：-196℃液氮
第二节 基因工程抗体技术
基因工程抗体：利用DNA重组及蛋白工程技术，从基因水平对编码抗体的基因进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体
分为两部分内容：
①对已有的抗体进行改造——人源化抗体
②抗体库制备——合成抗体库
人源化抗体：保留亲本抗体的亲和力和特异性，减少抗体的异源性
最主要优点是异源性低而有利于应用于人体
组合抗体库技术：使轻、重链可变区随机组合，可产生新的轻重涟配对法技术
第五章 凝集反应
第一节 凝集反应
1.凝集反应：细菌、红细胞等颗粒性抗原或表面覆盖可溶性抗原（或抗体）的颗粒性物质（如红细胞、聚苯乙烯胶乳等），与相应的抗体（或抗原）结合，在一定条件下，形成肉眼所见的凝集团块现象。
优点：方法简便，不要特殊仪器设备
2.类别：直接凝集试验、间接凝集试验
第二节 直接凝集反应
1.直接凝集试验：细胞性抗原，在有电解质存在的情况下，直接与相应抗体结合出现的肉眼可见的凝集现象
凝集原——抗原（细胞性：细菌、红细胞、螺旋体、白细胞、血小板）
凝集素——抗体
2.直接凝集法分为：玻片法和试管法
①玻片法：为定性试验方法，已知抗体→测抗原；常用于：菌种鉴定和血清学分型、ABO血型的鉴定
②试管法：为半定量试验方法，已知抗原→测抗体有无和效价；常用于：外斐试验、交叉配血、肥达反应
肥达反应：伤寒菌凝集试验，用已知伤寒菌的H（鞭毛）抗原和O（菌体）抗原以及甲型（A）与乙型（B）副伤寒沙门菌H抗原的标准液与病人血清做凝集试验，用于伤寒、副伤寒的铺助诊断
外斐反应（Weil-Felix）：变形杆菌与立克次体之间有相同的抗原表位，故可用变形杆菌代替立克次体抗原与怀疑立克次体感染的病人的血清做凝集试验，协助诊断斑疹伤寒（立克次体病）
嗜异性凝集试验：
1.用于诊断传染性单核细胞增多症的试验
2.传染性单核细胞增多症是由EB病毒感染所致，患者发病早期血清中出现一种IgM型抗体，能非特异性地凝集绵羊红细胞，称为“嗜异性抗体”
第三节 间接凝集反应
间接凝集反应：是用人工的方法将可溶性抗原（或抗体）吸附或偶联于免疫无关的颗粒上，使之成为致敏载体颗粒，再与相应的抗体（或抗原）作用，在适宜电解质存在的条件下，出现的特异性凝集现象
①正向间接凝集试验：用抗原致敏载体检测抗体
②反向间接凝集试验：用抗体致敏载体检测抗原
第四节 间接血凝试验
间接血凝试验原理：将抗原（或抗体）包被于红细胞表面，成为致敏载体，然后与相应的抗体（或抗原）结合，从而使红细胞被动的凝聚在一起，出现可见的凝集现象
载体：红细胞，最常用的为绵羊、家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞
阳性：红细胞凝集，则分布于孔底周围
阴性：红细胞沉积于孔底，集中呈一圆点的为不凝集
间接血凝抑制试验：正向间接血凝抑制试验
原理：抗原致敏的红细胞及相应抗体（诊断试剂），检测标本中是否具有与致敏载体相同的抗原
第五节 协同凝集试验
协同凝集试验：金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）（载体）+非特异性结合lgG的Fc段（致敏的颗粒载体）+特异性抗原（未知）→凝集现象
适用于：可溶性抗原检测
第六节 乳胶凝集试验
胶乳凝集试验原理：可溶性抗原（抗体）+胶乳颗粒——检测未知的抗体（抗原）
胶乳颗粒：为聚苯乙烯胶乳，可物理吸附IgG或蛋白抗原分子
应用于：检测抗溶血素O、类风湿因子
分为试管法和玻片法两种
胶乳凝集试验的灵敏度低于凝血试验
第七节 抗人球蛋白试验
1.抗人球蛋白试验（Coombs试验）：是检测红细胞不完全抗体的方法
抗原（红细胞性抗原）+不完全抗体+抗IgG的抗体→血凝现象
2.类型：
①直接抗人球蛋白试验：检测红细胞表面结合的不完全抗体
红细胞表面粘附IgG类不完全抗体+试剂2：Coombs试剂→红细胞凝集
②间接抗人球蛋白试验：检测游离于血清中的不完全抗体
血清中游离的不完全抗体+试剂1：试验用红细胞→不完全抗体黏附在红细胞表面+试剂2：Coombs试剂→红细胞凝集
第八节 冷凝集试验
冷凝集素综合征：免疫球蛋白（IgM）引起的自体免疫性疾病
特点：
- 在较低的温度下，这种抗体能作用于患者自己的红细胞，在外周的末梢微循环发生疑集，导致手足紫绀症。当温度上升至20~25℃时，补体激活，破坏红细胞发生溶血。在37℃温度，抗体与红细胞抗原发生完全可逆的分解，症状迅速消失
- 冷凝集素试验阳性：在体外，抗体与抗原发生作用的最适宜温度是0℃~4℃，在37℃或31℃~32℃以上的温度，抗体与红细胞解离
- 血涂片红细胞呈缗钱状及自身凝集现象
- 直接抗人球蛋白呈阳性
第六章 沉淀反应
第一节 沉淀反应
1.沉淀反应：是可溶性抗原与相应抗体在特定条件下特异性结合所出现的沉淀现象
2.对抗体的要求：特异性强、效价高
亲和力强（R型抗体）
不能使用H型抗体（马来源的抗血清，亲和力弱）
3.分类：液体内沉淀试验、凝胶内沉淀试验
第二节 液体内沉淀实验
免疫浊度测定：可溶性抗原与相应抗体特异性结合，在二者比例合适时，在特殊的缓冲液（通常用磷酸盐缓冲液）中快速形成一定大小的抗原抗体复合物/免疫复合物（IC），使反应液体出现浊度
①透射比浊法-吸光度：IC越多，光线吸收也越多
②散射比浊法-散射光：与IC的含量成正比
用仪器检测：现代光学测量仪器与自动分析检测系统
散射比浊法：分为终点散射比浊法和速率散射比浊法（最敏感的方法）
- 终点散射比浊法：让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平衡后，测定其复合物的量
- 速率散射比浊法：是一种动力学测定方法，在抗体过量的前提下，抗原抗体反应速度由慢到快，连续动态检测此过程，选取速率最大，且与被测物浓度变化呈线性关系的速率峰值，制作剂量-反应曲线，通过计算机可获得被测物浓度的量
区别：采集的测定信号不同、速率散射比浊法用于酶活性测定较准确
免疫浊度测定：应用了抗原抗体复合物形成后干扰光线的原理可以用仪器进行检测的特点，将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应，可以对各种液体内介质中的微量抗原、抗体和药物及其小分子半抗原物质进行定量检测
血清免疫球蛋白（Ig）常规定量检测方法是：
- 免疫比浊法（最常用的方法）
- 单向免疫扩散法（基层医院使用的方法）
第三节 凝胶内沉淀试验
1.单相琼脂扩散试验：将定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，在抗原抗体相遇比例合适的部位，两者体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原的浓度呈正相关。抗原浓度越高，沉淀环直径越大
用单项扩散法检测的是：IgG、lgA、IgM、补体（基层医院采用）
单向琼脂扩散法测定免疫球蛋白每次测定时必须同时制作准曲线，可用来定量测定
单向琼脂扩散法的检测敏感度不高，检测时间长达48~72小时
2.双相琼脂扩散试验：将可溶性的抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例适当处形成肉眼所见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩散的速率有关
根据沉淀线估计抗原或抗体的存在与否以及相对含量：
- 沉淀线如果靠近抗原孔，则表示抗体含量较大
- 沉淀线如果靠近抗体孔，则表示抗原含量较大
- 不出现沉淀线则表明无对应的抗体或抗原过量
根据沉淀线分析抗原或抗体相对分子量：
- 分子量小者扩散快，反之则较慢
- 由于慢者扩散圈小，局部浓度则较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方
- 如果两者分子量大致相等，则形成直线
抗体效价的测定：
①将经过系列稀释的抗血清分别与一个浓度的抗原反应
②同时稀释抗原和抗血清，分别与不同浓度的抗血清进行双向免疫扩散试验（称为棋盘滴定：选择抗体的最适工作浓度）
第四节 免疫电泳技术
免疫电泳技术：直流电场作用下的凝胶扩散试验，是电泳分析和沉淀反应的结合产物。免疫电泳技术能大大提高抗原和抗体的扩散，也能提高反应的的敏感度和缩短反应的时间
分类：
- 对流免疫电泳
- 火箭免疫电泳
- 免疫电泳
- 免疫固定电泳
- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
对流免疫电泳：双向免疫扩散与电泳相结合的直流电场中的定向加速的免疫扩散技术
在pH值8.6的琼脂凝胶中
- 抗体：受电渗作用向负极泳动
- 抗原：在电场力的作用下向正极泳动
- 某蛋白的等电点PI为4.8，它在pH8.2的缓冲液中呈何种离子性质负离子
- 等电点Pl=环境pH不带电
- 等电点PI<环境pH负电
- 等电点PI>环境pH正电
- 电场中带电化合物的分子带净电荷多少取决于电泳时缓冲液的pH值
缓冲液pH值偏离等电点越远蛋白质带电愈多，电泳速度愈快
一、火箭免疫电泳
- 火箭免疫电泳是一种单向免疫扩散试验与电泳结合的免疫技术（定向加速度的单向扩散试验）
- 原理：将抗体混于琼脂中，电泳时，抗体不移动，抗原由负极向正极泳动，随着抗原浓度减少，抗原抗体形成免疫复合物沉淀带越来越窄，形成火箭状的沉淀峰，峰的高低与抗原量成正比
- 火箭免疫电泳时，沉淀峰顶部呈不清晰的云努状提示电泳未达终点
二、免疫电泳
原理：区带电泳与双向免疫扩散相结合的免疫化学分析技术
- 先用区带电泳技术将蛋白质抗原按其所带电荷、分子量和构象不同，在凝胶中电泳分成不同的区带
- 然后与电泳方向平行，挖一小槽，加入相应的血清（抗人全血清），做双扩，各区带相应位置与抗体形成肉眼可见的弧形沉淀线
- 根据沉淀弧的数量、位置和形态，分析标本中各抗原成分
